BacterStain™ Bộ thuốc nhuộm Ziehl Neelsen

Làm tiêu bản

• Chuẩn bị lam kính sạch, không xước vỡ, nhúng vào dung dịch ethanol 95%.
• Sử dụng kẹp gắp lam kính, để ráo cồn, hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn.
• Dán nhãn thông tin mẫu bệnh phẩm.
• Sử dụng bút viết kính khoanh tròn, đánh dấu vị trí phết bệnh phẩm, ở mặt dưới lam kính.
• Bệnh phẩm lâm sàng nghi ngờ có chứa Mycobacterianhư: Đàm, dịch phế quản, dịch não tủy, một số loại dịch khác, mô … Hoặc khuẩn lạc (khóm) từ nuôi cấy thuần.
• Ly tâm bệnh phẩm, đổ bỏ nước nổi, lấy cặn.
• Sử dụng que cấy vô trùng lấy 1 vòng ăng (đường kính 3mm), hoặc nhỏ một giọt bệnh phẩm lên lam kính.
• Nếu là đàm:

+ Mở nắp cốc đàm nhẹ nhàng, đặt nắp ngửa trên khay inox.

+ Sử dụng đầu vát của que phết bằng chọn lấy chỗ đàm nhầy mủ nhẹ nhàng cắt mẩu đàm bằng phương pháp di cạnh vát que gỗ vào thành cốc đàm (lưu ý: mỗi bệnh phẩm sử dụng que phết riêng).

+ Đậy nắp cốc đàm.

+ Đặt que phết có mẫu bệnh phẩm vào giữa lam kính và dàn theo vòng xoắn ốc từ trong ra ngoài, dàn đều đặn liên tục tạo độ mịn, dày vừa phải hình ô van kích thước dài 2 cm rộng 1cm.

+ Ngâm que phết sau khi dàn vào dung dịch sát khuẩn phenol 5% hoặc Javel 0,5%.

Cố định tiêu bản

• Để tiêu bản khô tự nhiên trong tủ ATSH hoặc làm khô ở 60 ⁰C
• Cố định tiêu bản.
• Đặt tiêu bản lên mâm kính và để tiêu bản khô tự nhiên hoàn toàn ở nhiệt độ phòng (18 – 25 ⁰C).

Phủ thuốc nhuộm

• Đặt tiêu bản lên giá nhuộm.
• Nhuộm màu:

+ Phủ đầy dung dịch Carbol fuchsin (Code: 04004) lên mặt tiêu bản đã được cố định.

+ Hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bốc hơi (không được để sôi) 1 lần.

+ Để nguội tự nhiên trong 5 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

• Tẩy màu:

+ Phủ đầy dung dịch Alcohol acid (Code: 04009)

+ Duy tiêu bản trong 2 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.

• Nhuộm nền:

+ Phủ dung dịch Methylene blue (Code: 04006) trong 1-2 phút.

+ Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ

• Làm khô tiêu bản trước khi soi kính.

Soi kính hiển vi

• Lau thị kính, vật kính và tụ quang bằng giấy lau chuyên dụng.
• Xoay vật kính X10 vào trục quang học.
• Đặt tiêu bản lên mâm kính, sử dụng vật kính X10 để lấy vi trường.
• Nhỏ một giọt dầu soi vào đầu trái của vết dàn, để giọt dầu rơi tự do không chạm đầu ống nhỏ giọt vào vết dàn tránh nhiễm chéo.
• Xoay vật kính X100 vào trục quang học. Dầu soi tạo thành 1 lớp mỏng giữa vật kính X100 và tiêu bản.
• Không để vật kính chạm tiêu bản.
• Điều chỉnh ốc vi cấp nhẹ nhàng để nhìn hình ảnh rõ nét.
• Cách soi: cần phải hệ thống và chuẩn hóa, soi dòng giữa từ trái sang phải (tương đương với 100 vi trường). Điều chỉnh ốc vi cấp cho hình ảnh rõ nét nhất, quan sát kỹ từ ngoại vi vào trung tâm vi trường để phát hiện AFB. Đọc xong vi trường thứ nhất, chuyển sang đọc các vi trường kế tiếp cho đến hết dòng. Khi cần đọc >100 vi trường, chuyển dòng kế tiếp từ phải qua trái

ĐỌC KẾT QUẢ

• Mycobacterria: màu đỏ/ hồng.
• Canh trường còn lại: màu xanh dương

Hình ảnh AFB từ bệnh phẩm: AFB có hình que mảnh, hơi cong, bắt màu đỏ, đứng riêng biệt hay xếp thành từng cụm, dễ nhận biết trên nền xanh. Đếm số lượng AFB và ghi kết quả theo qui định như bảng 1.